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人类冠状病毒NL63为正链单股RNA病毒，具有外膜，其基因组长约27000nt，共包含七个开放阅读框，包括冠状病毒皆有的复制酶（1a/1b）和刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、外膜蛋白（E）与衣壳蛋白（N）等四种结构蛋白，以及一个辅助蛋白ORF3。此病毒刺突蛋白的N端有一长179个胺基酸的独特序列，变异性大且不见于其他冠状病毒中，可能与逃逸免疫系统的攻击有关。ORF3则编码一N端具糖基修饰、长225个胺基酸的蛋白质，其序列与一些同属病毒的辅助蛋白相似，可能作为一种结构蛋白组装到病毒中，并可能与病毒出芽离开宿主细胞有关。
冠状病毒均是以刺突蛋白结合宿主细胞表面的受体造成感染，NL63病毒使用的受体与SARS-CoV和SARS-CoV-2同为血管紧张素转化酶2（ACE2），但除刺突蛋白和ACE2的结合外，有实验结果显示NL63病毒的膜蛋白可和宿主细胞表面的糖蛋白硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）结合，但仍须有刺突蛋白才能成功感染。
早期有研究指人类冠状病毒NL63与229E病毒序列的相似度为65%，与猪流行性腹泻病毒（PEDV）的相似度为61%，但其膜蛋白（M）基因3端的部分序列与PEDV较为相似，显示NL63病毒演化的早期可能与PEDV病毒在该区域发生了重组。分子钟分析显示NL63病毒与229E病毒在距今约1000年前从共同祖先分支，随后NL63病毒又渐分成两大演化支，但两演化支间又因感染同一宿主而多次发生重组。不过2009年，有研究发现蹄蝠属蝙蝠中的冠状病毒与229E病毒的亲缘关系，比后者与NL63病毒的关系更为接近，两者可能在距今约200多年前才由共同祖先分支；2010年有研究人员在美国Perimyotis subflavus体内发现了一种新型冠状病毒Appalachian Ridge CoV（ARCoV.2），此病毒与人类冠状病毒NL63亲缘关系接近，分子钟分析显示两病毒可能在距今563—822年前由共同祖先分支，NL63病毒并可在三色蝠肺细胞株中复制增殖。这些研究显示NL63病毒与229E病毒可能是分别自不同蝙蝠病毒演化而来。
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