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奈米孔定序（Nanopore sequencing），又称奈米孔定序，是一种针对核酸（RNA与DNA）进行测序的第三代定序技术。奈米孔定序技术不同于过去的基因定序技术，无须对样品进行聚合酶链式反应或化学标记即可对一条DNA或RNA分子进行定序。奈米孔定序可以相对低廉的成本对个体进行基因型分型成本相对低廉，并具可携带性高、样品处理的过程简易快速与可以即时分析结果等优点。目前奈米孔定序已被广泛应用在各种领域，如病原体的快速检测、监测伊波拉病毒爆发的情况、环境微生物监测、食品安全监控、人类基因体定序、植物基因体定序、抗生素抗药性检测 、分析及其他相关应用。
奈米孔定序主要是利用电泳的方式将一个未知序列的样品输送穿过一个直径约1奈米孔。这个奈米孔系统会借由施以固定的外加电场在电解液上产生的可侦测电流讯号，其穿过奈米孔的电流讯号强弱则会与奈米孔孔径大小及通过此奈米孔核酸的组成有关。当此奈米孔孔径够狭小时，样品穿过此奈米孔道时便能造成独特的电流讯号改变，这样的机制也让使用奈米孔定序一事变得可能。其穿过单个奈米孔的电流大小可定义为单位时间内通过这个奈米孔的电荷量。
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