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β-内醯胺抗生素被用来进行预防和治疗受此类抗生素打击的细菌的感染力。过去β-内醯胺抗生素只被用来对付革兰氏阳性菌，但是通过发展可以对付各种革兰氏阴性菌的广谱β-内醯胺抗生素提高了其作用范围。
β-内醯胺抗生素是一种杀菌剂，它抑制细菌细胞壁中肽聚糖的形成。肽聚糖对细菌的细胞壁影响很大、尤其对革兰氏阳性菌细胞壁的结构强度而言。肽聚糖合成的最后一步是由称为青霉素结合蛋白的转肽酶完成的。
β-内醯胺抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸类似，其末端的氨基酸吸附在正在形成的肽聚糖的前兆NAM-NAG肽单元上。β内醯胺抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合。β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合。这个不可逆的结合使得青霉素结合蛋白无法链接正在形成的肽聚糖层。此外这个结合还可能激活细胞壁中的自溶酶。
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